Synthese von Deoxynivalenol-3-\u03b2-D-[13C6]-Glucosid und Multimykotoxinanalytik von Fusarium Toxinen in Gerste, Malz und Bier <\/p>\n\n\n\n
ISBN: 978-3-945762-03-5 <\/p>\n\n\n\n
<\/p>\n\n\n\n
254 Seiten, 45 Abbildungen, 88 Tabellen, Format DIN A5 <\/p>\n\n\n\n
Kurz-Zusammenfassung:<\/strong> Habler K, Moghari S, Rychlik M <\/strong>(2018) Analysis of Fusarium<\/em> Toxins in Single Barley Malt Kernels, Journal of Analysis and Testing, https:\/\/doi.org\/10.1007\/s41664-018-0057-5<\/a> (open access)<\/p>\n\n\n\n Gei\u00dfinger C, Hofer K, Habler K<\/strong>, He\u00df M, H\u00fcckelhoven R, Rychlik M, Becker T, Gastl M (2017) Fusarium Species on Barley Malt: Is Visual Assessment an Appropriate Tool for Detection? Cereal Chemistry, 94: 659-669, DOI: http:\/\/dx.doi.org\/10.1094\/CCHEM-08-16-0212-R <\/a><\/p>\n\n\n\n Habler K, Gotthardt M, Sch\u00fcler J, Rychlik M<\/strong> (2017) Multi-mycotoxin Stable Isotope Dilution LC-MS\/MS Method for Fusarium Toxins in Beers, Food Chemistry, 218: 447-454, DOI: 10.1016\/j.foodchem.2016.09.100<\/a> (green open access)<\/a><\/p>\n\n\n\n Habler K, Gei\u00dfinger C, Hofer K, Sch\u00fcler J, Moghari S, Hess M, Gastl M, Rychlik M<\/strong> (2017) Fate of Fusarium Toxins during Brewing, J. Agric. Food Chem., 65: 190-198 DOI: 10.1021\/acs.jafc.6b04182<\/a>\u00a0 (green open access)<\/a> <\/p>\n\n\n\n Habler K, Frank O, Rychlik M<\/strong> (2016) Chemical Synthesis of Deoxynivalenol-3-\u03b2-d-[13<\/sup>C6<\/sub>]-Glucoside and Application in Stable Isotope Dilution Assays, Molecules, 21: 838<\/a> (open access) <\/p>\n\n\n\n Hofer K, Barmeier G, Schmidhalter U, Habler K<\/strong>, Rychlik M, Huckelhoven R, Hess M (2016) Effect of nitrogen fertilization on Fusarium head blight in spring barley, Crop Protection 88: 18-27, doi: 10.1016\/j.cropro.2016.05.007<\/a>\u00a0 <\/p>\n\n\n\n Habler K, Hofer K, Gei\u00dfinger C, Sch\u00fcler J, H\u00fcckelhofen R, Hess M, Gastl M, Rychlik M <\/strong>(2016) Fate of Fusarium Toxins during the Malting Process J. Agric. Food Chem., 64: 1377-1384, doi: 10.1021\/acs.jafc.5b05998<\/a> (green open access<\/a>)<\/p>\n\n\n\n Habler K, Rychlik M<\/strong> (2016) Multi-mycotoxin Stable Isotope Dilution LC-MS\/MS Method for Fusarium Toxins in Cereals, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408: 307-317, doi: 10.1007\/s00216-015-9110-7<\/a>\u00a0 (green open access<\/a>)<\/p>\n\n\n\n Zusammenfassung (ausf\u00fchrlich):<\/strong> In der vorliegenden Arbeit wurden in Summe drei\nLC-MS\/MS-Methoden entwickelt. Zwei Multimykotoxin-Methoden basierten auf Stabilisotopenverd\u00fcnnungsanalysen\n(SIVAs) kombiniert mit einer Matrixkalibrierung zur simultanen Bestimmung von\n14 Fusarium<\/em> Toxinen in Getreide und\nBier. In die LC-MS\/MS-Methode f\u00fcr Getreide wurden die Fusarium<\/em> Toxine NIV, DON, 3-AcDON, 15-AcDON, FUSX, HT2, T2, ZEN,\nENN B, B1, A1, A und BEA sowie das modifizierte Mykotoxin D3G integriert. Die\nLC-MS\/MS-Methode f\u00fcr Bier beinhaltete die Mykotoxine D3G, DON, 3-AcDON,\n15-AcDON, HT2, T2, ZEN und ENN B. Um Ionensuppressionseffekten entgegenzuwirken,\nfanden zur Aufreinigung von Getreide- und Bierproben Kartuschen des Typs \u201eBond Elut Mycotoxin\u201c (Agilent Technologies)\nAnwendung. Die Messungen erfolgten im ESI-Modus bei negativer Ionsierung\nf\u00fcr die Analyte NIV, D3G und ZEN und bei positiver Ionisierung f\u00fcr die Analyte\nDON, 3-AcDON, 15-AcDON, FUSX, HT2, T2, ENN B, ENN B1, ENN A1, ENN A und BEA. Der\nnegative Probenlauf dauerte inklusive Equilibrierungszeit 27 Minuten und die\npositive Messung belief sich ebenfalls inklusive Equilibrierungszeit auf 35\nMinuten. Aus vorangegangenen Arbeiten standen die isotopenmarkierten Standards\n[13<\/sup>C2<\/sub>]-3-AcDON, [13<\/sup>C4<\/sub>]-T2, [15<\/sup>N3<\/sub>]-ENN\nB, [15<\/sup>N3<\/sub>]-ENN B1, [15<\/sup>N3<\/sub>]-ENN A1, [15<\/sup>N3<\/sub>]-ENN\nA und [15<\/sup>N3<\/sub>]-BEA zur Verf\u00fcgung. Zusammen mit den\nkommerziell erh\u00e4ltlichen isotopenmarkierten Analoga [13<\/sup>C15<\/sub>]-DON\nund [13<\/sup>C22<\/sub>]-HT2 wurden die Fusarium Toxine DON, 3-AcDON,\nHT2, T2, Enniatine und BEA mittels SIVA quantifiziert. Der Gehalt an 15-AcDON\nwurde bei beiden Methoden \u00fcber den internen Standard [13<\/sup>C2<\/sub>]-3-AcDON\nbestimmt und der Gehalt an D3G in Bier wurde bis zur Synthese des isotopologen\nStandards [13<\/sup>C6<\/sub>]-D3G \u00fcber [13<\/sup>C15<\/sub>]-DON\nermittelt. Die Toxine NIV, D3G, ZEN und FUSX wurden bei der Getreidemethode \u00fcber\neine Matrixkalibrierung quantifiziert, wobei als Matrix St\u00e4rke oder analytfreie\nanaloge Probenmatrices verwendet wurden. In Bier wurde ZEN ebenfalls \u00fcber eine\nMatrixkalibrierung bestimmt. Als Matrix diente hierbei analytfreies,\nkommerziell erh\u00e4ltliches Bier. D3G und DON wiesen im positiven Modus dasselbe\nFragementierungsmuster auf, da es zu einer sogenannten \u201ein-source-Fragmentierung\u201c\nund Abspaltung der Glucose von D3G kommt. Um nicht die Summe aus D3G und DON,\nsondern beide Analyte getrennt voneinander quantifizieren zu k\u00f6nnen, war eine\nchromatographische Trennung notwendig. Dies konnte mit der verwendeten\nHPLC-S\u00e4ule (YMC Hydrosphere) und einem bestimmten Gradientenprogramm erzielt\nwerden. <\/p>\n\n\n\n Beide LC-MS\/MS-Methoden wurden einer sorgf\u00e4ltigen\nValidierung unterzogen und Parameter hinsichtlich Nachweis- und\nBestimmungsgrenzen, Wiederfindungen sowie Ger\u00e4te- und Wiederholpr\u00e4zisionen\nermittelt. <\/p>\n\n\n\n Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der\nMultimykotoxin-LC-MS\/MS-Methode von Fusarium<\/em>\nToxinen in Getreideproben lagen zwischen 0,1 \u00b5g\/kg und 5 \u00b5g\/kg bzw. zwischen 0,2\n\u00b5g\/kg und 15 \u00b5g\/kg. Eine Ausnahme bildeten die Analyten D3G und NIV, die\njeweils um einen Faktor 2 bzw. einen Faktor 13 unempfindlicher waren. Wie von\neiner SIVA zu erwarten, lagen die Wiederfindungen der entsprechenden Analyten bei\nallen Dotierniveaus nahe bei 100%. Bei den Analyten, die \u00fcber eine\nMatrixkalibrierung quantifiziert wurden, ergaben sich Wiederfindungsraten\nzwischen 79% und 117%. Die Ger\u00e4tepr\u00e4zisionen waren \u00e4hnlich den Wiederholpr\u00e4zisionen,\nunabh\u00e4ngig von SIVA und Matrixkalibrierung, und lagen jeweils unterhalb 6% bzw.\n12%. Die Richtigkeit der Methode wurde mit zertifizierten Referenzmaterialien\nanhand von DON in Mais und HT2 sowie T2 in Haferproben best\u00e4tigt. Die\nAbweichung von gefundenem Wert zu Referenzwert betrug maximal 6,7%. Die\nBestimmungsgrenzen von DON und ZEN waren mindestens einen Faktor 80 unterhalb\nder gesetzlichen Grenzwerte in unverarbeitetem Getreide in H\u00f6he von 1250 \u00b5g\/kg\nf\u00fcr DON und 100 \u00b5g\/kg f\u00fcr ZEN. <\/p>\n\n\n\n Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der\nMultimykotoxin-LC-MS\/MS-Methode von Fusarium<\/em>\nToxinen in Bierproben lagen zwischen 0,05 \u00b5g\/L und 6,9 \u00b5g\/L bzw. zwischen\n0,15 \u00b5g\/L und 20 \u00b5g\/L. Die Wiederfindungsraten aller Dotierniveaus\nbefanden sich bei 100%. Bei ZEN, das \u00fcber eine Matrixkalibrierung quantifiziert\nwurde, befanden sich die Wiederfindungen ebenfalls im Mittel bei 100%. Eine\nAusnahme bildete 15-AcDON, dessen Wiederfindungen durchschnittlich bei 75% lagen.\nDie Ger\u00e4tepr\u00e4zisionen waren \u00e4hnlich den Wiederholpr\u00e4zisionen, unabh\u00e4ngig von\nSIVA und Matrixkalibrierung, und lagen jeweils unterhalb 5% bzw. 8%. <\/p>\n\n\n\n Mit den Multimykotoxin-LC-MS\/MS-Methoden wurden zahlreiche\nGerstenmalzproben, diverse Biere aus aller Welt sowie der Verlauf von Fusarium\nToxinen \u00fcber den kompletten M\u00e4lzungs- und Brauprozess untersucht. <\/p>\n\n\n\n Insgesamt 30 Gerstenmalzproben aus s\u00e4mtlichen deutschen\nBundesl\u00e4ndern wurden \u00fcber einen Zeitraum von drei Jahren gesammelt und auf ihr\nMykotoxinspektrum hin untersucht. Insbesondere im Jahr 2012 konnte ein h\u00e4ufiges\nVorkommen von D3G, DON und ENN B in hohen Konzentrationen festgestellt werden. Die\nmaximalen Gehalte dieser Toxine waren teilweise mit k\u00fcnstlich infiziertem\nProbenmaterial vergleichbar. Die Kontamination mit Typ A Trichothecenen, NIV,\nden acetylierten DON Derivaten 3-AcDON und 15-AcDON sowie BEA und den weiteren\nEnniatinen war weitaus unauff\u00e4lliger. FUSX konnte in keiner der analysierten\nProben nachgewiesen werden. Unter Einbeziehung der gesetzlichen Grenzwerte f\u00fcr\nunverarbeitetes Getreide h\u00e4tten zwei der untersuchten Gerstenmalzproben aufgrund\nder \u00dcberschreitung des zul\u00e4ssigen Gehaltes an DON und ZEN nicht in Verkehr\ngebracht werden d\u00fcrfen. <\/p>\n\n\n\n In Summe wurden 61 verschiedene, kommerziell erworbene\nbiologische und konventionelle Biere mit unterschiedlichen Alkoholgehalten aus\nDeutschland und der ganzen Welt auf ihr Toxinspektrum hin untersucht. Die\nBierproben waren teilweise in geringen Konzentrationen mit D3G, DON, 3-AcDON\nund ENN B kontaminiert. Die anderen in der Methode enthaltenen Mykotoxine, wie\n15-AcDON, HT2, T2 und ZEN, konnten in keinem Bier oberhalb der Nachweisegrenze\ndetektiert werden. In deutschen Bieren lag der h\u00f6chste Gehalt bei 28,8 \u00b5g\/L\nDON, 10,6 \u00b5g\/L D3G und 1,6 \u00b5g\/L 3-AcDON. Ein Pale Ale aus den USA \u00fcberstieg\ndieses Kontaminationsniveau und enthielt 34,5 \u00b5g\/L DON und 67,3 \u00b5g\/L D3G. In\nallen untersuchten Bieren traten DON und D3G mit einer durschnittlichen\nH\u00e4ufigkeit von 20% meistens zusammen in unterschiedlichen molaren Verh\u00e4ltnissen\nauf. Ein Zusammenhang zwischen Alkoholgehalt und Mykotoxinkonzentration konnte\nin den analysierten Bierproben nicht festgestellt werden. In Anbetracht der\nanalysierten Biere scheint auch bei h\u00f6herem Konsum ein unbedenkliches Gesundheitsrisiko\nf\u00fcr den Verbraucher von den untersuchten Mykotoxinen auszugehen. <\/p>\n\n\n\n Zur Untersuchung des Verhaltens von Fusarium<\/em> Toxinen \u00fcber den M\u00e4lzungs- und Brauprozess hinweg wurden\nzwei verschiedene Gerstensorten Grace und Scarlett jeweils mit drei\nunterschiedlichen Fusarium<\/em> Spezies (F. culmorum<\/em>, F. sporotrichioides<\/em> und F. avenaceum<\/em>)\ninokuliert, wobei auch nicht inokulierte Kontrollen gezogen worden sind. Die\nProbenahme erfolgte jeweils bei folgenden Prozessschritten: Rohfrucht, nach der\nWeiche, nach der Keimung, nach der Schwelke, nach der Darre, nach der Putze, Keimlinge,\nMaische, Pfannevollw\u00fcrze, Treber, Anstellw\u00fcrze, Hei\u00dftrub, Jungbier und fertiges\nBier nach Filtration. In den w\u00e4hrend des M\u00e4lzungsprozesses gezogenen Proben\nwurde von den Kooperationspartnern via qPCR zus\u00e4tzlich die Fusarium<\/em> DNA Konzentration bestimmt. Es zeigten sich unabh\u00e4ngig von\nGerstensorte signifikante Korrelationen zwischen Fusarium<\/em> DNA und jeweiliger Toxinkonzentration. Unabh\u00e4ngig von den\nKultivaren zeigten die untersuchten Fusarium<\/em>\nToxine jeweils einen \u00e4hnlichen Verlauf w\u00e4hrend des M\u00e4lzungs- und Brauprozesses.\nGenerell kam es in der Weichphase zu einer Reduktion der absoluten Mengen aller\nMykotoxine. W\u00e4hrend der folgenden Keimungs-, Schwelk- und teilweise auch\nDarrphase stiegen einhergehend mit der Fusarium<\/em>\nDNA\/Biomasse auch die Mykotoxingehalte an. Insbesondere das modifizierte\nMykotoxin D3G erfuhr eine Zunahme um mehrere tausend Prozent w\u00e4hrend der\nKeimung. Mit den Keimlingen konnte zwar ein Teil der Mykotoxine aus dem verbleibenden\nProzess entfernt werden, der Gro\u00dfteil der Fusarium<\/em>\nToxine gelangte aber mit dem fertigen Darrmalz bzw. Schrot in den Brauprozess. Die\nGehalte der Typ A Trichothecene stiegen beim Maischen etwa auf das Doppelte an,\nwobei sich die Typ B Trichothecene und Enniatine hingegen kaum ver\u00e4nderten. Der\nfolgende L\u00e4uterungsprozess kristllisierte sich vor allem f\u00fcr D3G als wesentlich\nheraus, da in Pfannevollw\u00fcrze lediglich 25% D3G bezogen auf den Anfangsgehalt\nin Schrot gefunden werden konnten. Durch weitere Brauversuche mit\nautoklaviertem und nicht autoklaviertem Malz konnte letztendlich nachgewiesen\nwerden, dass dieser Verlust an D3G auf malzenzymatische Modifizierungen\nzur\u00fcckgef\u00fchrt werden kann. F\u00fcr die Enniatine stellte sich ebenfalls das\nAbl\u00e4utern als wichtigster Schritt im Brauprozess heraus. \u00dcber die Treber\nkonnten insbesondere die Enniatine fast komplett aus der W\u00fcrze entfernt werden,\nso dass im fertigen Bier nur noch Spuren (maximal 0,5%) an Enniatinen\nnachgewiesen werden konnten. Alle untersuchten Fusarium<\/em> Toxine wurden w\u00e4hrend des Brauprozesses durch\nFermentierung, Reifung, Lagerung und Filtration nicht beeinflusst. Bezogen auf den\nAnfangsgehalt des eingesetzten Malzes verblieben im fertigen Bier letztendlich\njeweils 40% an DON, 3-AcDON und 15-AcDON sowie jeweils 100% an HT2 und T2. Durch\ndas inkonsistente Verhalten von D3G w\u00e4hrend des Brauprozesses ist von einem k\u00fcnftigen,\nrechnerisch ermittelten H\u00f6chstgehalt an D3G in Bier, der wie bei DON anhand der\nMalzsch\u00fcttung bestimmt wird, abzuraten. F\u00fcr eine m\u00f6gliche gesetzliche\nReglementierung von D3G w\u00fcrden sich separate Grenzwerte jeweils f\u00fcr Getreide\nund Bier anbieten.\n\nZus\u00e4tzlich\nkonnte im Zuge dieser Arbeit der isotopenmarkierte Standard Deoxynivalenol-3-\u03b2-D-[13<\/sup>C6<\/sub>]-Glucosid\nsynthetisiert werden. Dazu wurde die sogenannte K\u00f6nigs-Knorr-Methode\nangewendet, bei der unmarkiertes DON zusammen mit 2,3,4,6-Tetraacetyl-1-bromo-\u03b1-D-[13<\/sup>C6<\/sub>]-Glucopyranosid\nund dem Katalysator Ag2<\/sub>CO3<\/sub> in DCM zur Reaktion gebracht\nwurde. Nach Hydrolyse des acetylierten Produkts mit KOH in ACN\/H2<\/sub>O\nund pr\u00e4parativer Aufreinigung erfolgte die Strukturaufkl\u00e4rung des Deoxynivalenol-3-\u03b2-D-[13<\/sup>C6<\/sub>]-Glucosids\nmittels LC-MS\/MS und ein- bzw. zweidimensionaler NMR-Spektroskopie. Mit dem neu\nsynthetisierten isotopenmarkiertem Standard [13<\/sup>C6<\/sub>]-D3G\nund dem kommerziell erh\u00e4ltlichen internen Standard [13<\/sup>C15<\/sub>]-DON\nwurde eine LC-MS\/MS-Methode basierend auf einer SIVA f\u00fcr D3G und DON in Bier\nentwickelt, validiert und etabliert. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der\nSIVA von D3G und DON in Bierproben lagen bei 3,0 \u00b5g\/L und 1,5 \u00b5g\/L bzw.\nbei 8,8 \u00b5g\/L und 4,4 \u00b5g\/L. Trotz geringerer Einwaage waren die Nachweis- und\nBestimmungsgrenzen der SIVA von D3G und DON im Gegensatz zur\nMultimykotoxinanalytik von Bierproben um einen Faktor 2 geringer. Wie von einer\nSIVA zu erwarten, lagen die Wiederfindungen bei allen Dotierniveaus nahe bei\n100%. Die Ger\u00e4te- und Wiederholpr\u00e4zisionen waren bei maximal 0,5% bzw. 7%.\nLetztendlich wurden mit der SIVA verschiedene Biere aus diversen L\u00e4ndern\nuntersucht. D3G und DON konnten meistens zusammen in unterschiedlichen molaren\nVerh\u00e4tlnissen nachgewiesen werden, traten aber in den analysierten Bieren eher\nin geringen Konzentrationen mit maximal 63,3 \u00b5g\/L D3G und 28,3 \u00b5g\/L DON auf. \n\n\n\n<\/p>\n\n\n\n <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Synthese von Deoxynivalenol-3-\u03b2-D-[13C6]-Glucosid und Multimykotoxinanalytik von Fusarium Toxinen in Gerste, Malz und Bier ISBN: 978-3-945762-03-5 254 Seiten, 45 Abbildungen, 88 Tabellen, Format DIN A5 Kurz-Zusammenfassung: Fusarium Toxine sind hochgiftige… <\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"parent":74,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/233"}],"collection":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=233"}],"version-history":[{"count":6,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/233\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":244,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/233\/revisions\/244"}],"up":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/74"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=233"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}
Fusarium<\/em> Toxine sind hochgiftige Stoffwechselprodukte pflanzenpathogener Pilze, die Getreide kontaminieren und somit bis ins fertige Bier gelangen k\u00f6nnen. Um die aktuelle Belastungssituation von Braumalz und Bier sowie den Verlauf der Mykotoxine \u00fcber den M\u00e4lzungs- und Brauprozess erfassen zu k\u00f6nnen, wurden LC-MS\/MS-Multi-Mykotoxin-Methoden basierend auf einer Stabilisotopenverd\u00fcnngsanalyse (SIVA) f\u00fcr Getreide und Bier entwickelt. Zudem konnte mit dem neu synthetisierten isotopenmarkierten Standard Deoxynivalenol-3-\u03b2-D-[13<\/sup>C6<\/sub>]-Glucosid eine SIVA f\u00fcr Bierproben etabliert werden. <\/p>\n\n\n\nPublikationen aus der Dissertation:<\/h2>\n\n\n\n
<\/p>\n\n\n\n