doi:10.3390\/nu9050462<\/a> (open access)<\/p>\n\n\n\nZusammenfassung (ausf\u00fchrlich):<\/strong>
Mit Glutamins\u00e4ure konjugierte Derivate der Tetrahydropteroins\u00e4ure, kurz Folate, bilden eine Gruppe von essentiellen N\u00e4hrstoffen, zu deren Synthese der Mensch nicht bef\u00e4higt ist. Eine unzureichende Zufuhr oder genetische Faktoren f\u00fchren zu St\u00f6rungen des Folatmetabolismus, der unter anderem an Methylierungsreaktionen und der Synthese von DNA-Bestandteilen beteiligt ist. Zu den direkten oder indirekten Auswirkungen z\u00e4hlen unter anderem funktionelle Beeintr\u00e4chtigungen des zentralen Nervensystems und kardiovaskul\u00e4ren Erkrankungen. Eine maternale Folatunterversorgung kann zur Fehlbildung des embryonalen Neuralrohrs bzw. des sp\u00e4teren R\u00fcckenmarks (Spina bifida) oder einer Unterentwicklung des Gehirns sowie der Sch\u00e4deldecke (Anenzephalie) f\u00fchren. Die Fr\u00fcherkennung von Mangelerkrankungen mit Hilfe moderner analytischer Verfahren stellt daher eine wichtige Aufgabe f\u00fcr die klinische Analytik dar. Allerdings wurden fortschrittliche Probennahmetechniken und Diagnoseverfahren f\u00fcr die Folatanalytik bisher nicht in ausreichendem Ma\u00dfe entwickelt und validiert.
Deshalb wird in Kapitel I dieser Arbeit die Entwicklung von vier modernen, klinischen Anwendungen aus chemisch-analytischen Analyseverfahren und modernen Probennahmeverfahren, unter anderem zur Bestimmung des Gehalts an 5-Methyltetrahydrofolat (5-CH3-H4folat), dem bioaktiven Hauptvitamer, in getrockneten Blutstropfen (engl. dried blood spots, DBS) und absorptiven Mikrosamplern (engl. volumetric absorptive microsampler, VAMS) vorgestellt. Im Gegensatz zur konventionellen Analytik von 100 bis 2.000 \u03bcL Venenblut ist es mit Hilfe der neu entwickelten Verfahren erstmals m\u00f6glich, eine Bestimmung des Vollblut-5-CH3-H4folats aus 50 \u03bcL (DBS) oder 10 \u03bcL (VAMS) Vollblut als getrocknete Blutstropfen durchzuf\u00fchren. Einen wesentlichen Fortschritt stellt hierbei die autonome und mikroinvasive Entnahme von Kapillarblut aus der Fingerspitze nach Punktion des Zeigefingers und dessen Stabilisierung dar, welche eine aufw\u00e4ndige ven\u00f6se Blutabnahme unter Aufsicht von medizinischem Personal ersetzt. Die Extraktion erfolgt nach dem Prinzip der miniaturisierten Stabilisotopenverd\u00fcnnungsanalyse (SIVA) mit internem Standard gefolgt von einer selektiven und sensitiven Quantifizierung mittels Fl\u00fcssigchromatographie-Tandemmassenspekrometrie (LC-MS\/MS). Des Weiteren wird eine Methode zur Bestimmung des 5-CH3-H4folats aus getrockneten Plasmatropfen (engl. dried plasma spots, DPS) (30 \u03bcL) vorgestellt, die es k\u00fcnftig erm\u00f6glichen soll, langfristige Bioverf\u00fcgbarkeitsstudien probandenfreundlicher zu gestalten, da nur kleine Volumina an Venenblut je Entnahmezeitpunkt zur Gewinnung des Plasmas erforderlich sind und letzteres auf Ascorbins\u00e4ure-impr\u00e4gnierten Cellulosefasern bei -20\u00b0C stabilisiert werden kann. Ein absolutes Novum stellt die Analytik von Plasma-5-CH3-H4folat aus getrockneten Blutstropfen dar. Nach Einf\u00fchrung eines Erhitzungsschrittes zur Inaktivierung des Enzyms Dekonjugase wird in den Erythrozyten gespeichertes, mit Glutamins\u00e4ureeinheiten (n\u22653) konjugiertes 5-CH3-H4folat nicht in das im Plasma vorliegende Monolgutamat (n=1) umgewandelt, was eine ausschlie\u00dfliche und selektive Quantifizierung des Plasmafolats in Vollblut erlaubt. Die Anwendbarkeit der Methoden konnte anhand der Ergebnisse aus einer Bioverf\u00fcgbarkeitsstudie (DPS) und einem Probandenscreening (DBS, VAMS) aufgezeigt werden.
Die im vorigen Abschnitt genannte Analytik erlaubt die Diagnose eines Folatmangels, beleuchtet aber nicht die organspezifischen Auswirkungen eines di\u00e4tinduzierten Folatmangels. Von entscheidender Bedeutung zum Verst\u00e4ndnis der Funktionsweise eines di\u00e4tinduzierten Folatmangels auf physiologischer Ebene ist die simultane Betrachtung von Zielmetaboliten aus dem Folat- und Methioninzyklus. Eine derartig detaillierte Betrachtung ausgew\u00e4hlter Metabolite aus beiden Stoffwechselwegen wurde im Rahmen von Tierversuchen bisher nicht durchgef\u00fchrt. Als problematisch erwiesen sich bisher die geringen Organgewichte von M\u00e4usen und die unterschiedlichen Extraktionsbedingungen f\u00fcr Folate und C1-Metabolite.
In Kapitel II wird deshalb die Entwicklung und Validierung von drei neuen SIVA-LC-MS\/MS Verfahren vorgestellt, die eine Bestimmung von 6 Folatvitameren in Gewebeproben und 3 C1-Metaboliten in Gewebeproben und Plasma erm\u00f6glichen. Eine Untersuchung von Folaten und C1-Metaboliten aus einem Zielorgan wird durch einen Gefriertrocknungs- und Homogenisierungsschritt m\u00f6glich, welcher den separaten Extraktionsbedingungen f\u00fcr die jeweilige Analytgruppe als gemeinsamer Schritt vorangestellt ist. Die Analytik zielt ab auf die Betrachtung des gewebespezifischen Folatstatus sowie die Vitamerenverteilung und die Konzentrationen von S-Adenosylmethionin (AdoMet) und S-Adenosylhomocystein (AdoHcy) in Leber, Niere, Herz und Gehirn als Organe und Teile jener Systeme, in denen sich Folatmangelerkrankungen prim\u00e4r manifestieren. Als klinischer Marker f\u00fcr einen Folatmangel dient der Gesamtplasmahomocystein- (engl. total homocysteine, tHcy) und der Erythrozyten-5-CH3-H4folat Gehalt. Die Folatmangelstudie wurde mit m\u00e4nnlichen C57BL\/6N-M\u00e4usen (n=6 Folat-arme Di\u00e4t, n=6 Folat-haltige Di\u00e4t, 12 Wochen) durchgef\u00fchrt. Mit Hilfe der neu entwickelten Methoden konnte erstmals gezeigt werden, dass ein nutritiver Folatmangel zu einer Abnahme von jeweils 50% des 5-CH3-H4folat Gehalts in Erythrozyten (enthalten 100% 5-CH3-H4folat) sowie des organspezifischen Gesamtfolatgehalts in Leber, Niere und Herz f\u00fchrt. Deshalb ist die Bestimmung von Erythrozyten-5-CH3-H4folat als diagnostischer Parameter zur Erfassung der endogenen Folatspeicher bzw. des momentanen, organspezifischen turn-overs gerechtfertigt. Im Gehirn betr\u00e4gt die Abnahme hingegen nur 17%, was auf hochaffine Transportsysteme zur\u00fcckzuf\u00fchren ist. THcy in Plasma stellt mit einer Zunahme von 33,7% einen unspezifischen Marker dar, da es nicht mit endogenen Metabolitkonzentrationen korreliert. In allen Organen, au\u00dfer dem Herz (haupts\u00e4chlich 5-CH3-H4folat), stellt die Tetrahydrofols\u00e4ure (H4folat) das Hauptvitamer dar. Aufgrund der signifikanten Abnahme (p<0,05) des Folatstatus und der Methylierungskapazit\u00e4t (AdoMet\/AdoHcy Verh\u00e4ltnis), begleitet von einer gleichzeitigen Zunahme an AdoHcy (p<0,05), erwiesen sich Hepatozyten als besonders anf\u00e4llig gegen\u00fcber einem nutritiven Folatmangel.
Neben der Aufnahme von Folaten \u00fcber die Nahrung wird der Beitrag der im Darm mikrobiell synthetisierten Folate zum Folatstatus des Menschen diskutiert. Bisher ging man davon aus, dass folatproduzierende Bakterien, zu denen vor allem die Bifidobakterien geh\u00f6ren, Folate im \u00dcberschuss produzieren, diese \u00fcber bislang unbekannte Transportmechanismen aktiv ausschleusen und dem Wirt unmittelbar zur Verf\u00fcgung stellen. Allerdings basiert die Existenz eines solchen, aktiven Transports bisher nur auf Vermutungen. In Kapitel III werden Ergebnisse von in vitro Studien zur Folatfreisetzung mit den folatproduzierenden, humanen Darmbakterien B. adolescentis DSM 20083T und B. pseudocatenulatum DSM 20438T in Folat-freiem Medium (FFM) vorgestellt. Dabei werden die Anreicherung von Folatvitameren im Kulturmedium und die zellul\u00e4re Folatakkumulation in Abh\u00e4ngigkeit der Zeit und der Viabilit\u00e4t der Zellen mit Hilfe von vier neu entwickelten und validierten SIVA-LC-MS\/MS-Methoden und einer mikrobiologischen Viabilit\u00e4tsbestimmung ermittelt. B. adolescentis DSM 20083T und B. pseudocatenulatum DSM 20438T produzieren und akkumulieren bei Kultivierung in FFM haupts\u00e4chlich 5-CH3-H4folat, 5-HCO-H4folat (Summe aus 5-HCO-H4folat, 10-HCO-H4folat und 5,10-CH+-H4folat) und H4folat. H4folat ist als chemisch instabilstes Vitamer extrazellul\u00e4r im Gegensatz zu den substituierten Vitameren nicht nachweisbar. 5-CH3-H4folat, 5-HCO-H4folat und H4folat liegen als Polyglutamate mit einer Kettenl\u00e4nge von n\u22652 Glutamyleinheiten und bevorzugt als Tetraglutamat vor. Untersuchungen der intra- und extrazellul\u00e4ren Folatgehalte w\u00e4hrend der station\u00e4ren Phase von B. adolescentis DSM 20083T ergaben f\u00fcr den Zeitraum von 15 bis 45 h, dass die Zahl lebender Zellen sowie die zellul\u00e4re Konzentration an 5-CH3-H4folat und 5-HCO-H4folat konstant (p>0,05) bleibt, w\u00e4hrend die zellul\u00e4re H4folat-Konzentration stetig (p<0,05) abnimmt. Gleichzeitig nahm der Anteil toter Zellen an der Gesamtzellzahl linear zu. Im Medium kam es deshalb w\u00e4hrend demselben Zeitraum zur stetigen Anreicherung von 5-CH3-H4folat und 5-HCO-H4folat. 100% des 5-CH3-H4folats (nach Dekonjugation) sind dabei sowohl intra- als auch extrazellul\u00e4r auf 5-CH3-H4PteGlu4 zur\u00fcckzuf\u00fchren. Da polyglutamylierte Folate mit mehr als 2 Glutamylresten, wie bereits bei Lactobacillus casei gezeigt werden konnte, nicht aus der Zelle ausgeschleust werden k\u00f6nnen, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass 5-CH3-H4PteGlu4 ausschlie\u00dflich durch Zelllyse freigesetzt wird. Deshalb galt es mittels 5-CH3-H4folat als stabilem Marker zu pr\u00fcfen, ob das Verh\u00e4ltnis an lebenden und toten Zellen zu einem definierten Zeitpunkt (24 h, stat. Phase) dem Verh\u00e4ltnis der intrazellul\u00e4ren (lebende Zellen) und extrazellul\u00e4ren (tote Zellen) Stoffmenge an 5-CH3-H4folat nach Dekonjugation entspricht. Aus derselben Kultur galt es gleichzeitig den Grad der Polyglutamylierung von 5-CH3-H4folat (5-CH3-H4PteGlu2-4) zu ermitteln, da ab 3 Glutamylresten kein Ausschleusen des Markers stattfindet. Aus den Studien geht hervor, dass bei beiden St\u00e4mmen der prozentuale Anteil an lebenden und toten Zellen an der Gesamtzellzahl nach 24-st\u00fcndiger Kultivierung in FFM der relativen Stoffmenge an intrazellul\u00e4rem und extrazellul\u00e4rem 5-CH3-H4folat, bezogen auf die Gesamtstoffmenge in der Kultur, entspricht (p<0,05). Dabei entfallen wiederum 100% des 5-CH3-H4folats nach Dekonjuagtion auf 5-CH3-H4PteGlu4. Aus diesem in vitro Experiment l\u00e4sst sich erstmals fundiert ableiten, dass die in FFM kultivierten St\u00e4mme B. adolescentis DSM 20083T und B. pseudocatenulatum DSM 20438T nicht zu einem aktiven Export von 5-CH3-H4folat bef\u00e4higt sind und die extrazellul\u00e4re Anreicherung des Vitamers ausschlie\u00dflich eine Funktion der Zelllyse ist.
<\/p>\n\n\n\n<\/p>\n\n\n\n
Auszug aus dem Promotionsgutachten (Erstpr\u00fcfer Prof. Rychlik):
“ …Dementsprechend ist die Dissertation auch umfangreich geworden mit dem Ziel, alle zu ber\u00fccksichtigenden Aspekte umfassend zu erl\u00e4utern. Sprachlich treffend stellt das Werk eine Zusammenfassung des aktuellen Wissenstandes zur Bioverf\u00fcgbarkeit und klini\u00adschen Analytik des Folatmangels dar…. „<\/p>\n\n\n\n
<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Entwicklung und Anwendung von Stabilisotopenverd\u00fcnnungsanalysen zur Quantifizierung von Folaten in der klinischen Diagnostik sowie zur Charakterisierung folatproduzierender Bifidobakterien ISBN: 978-3-945762-04-2 398 Seiten, 108 Abbildungen, 84 Tabellen, Format DIN A4 Kurz-Zusammenfassung:… <\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"parent":74,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/174"}],"collection":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=174"}],"version-history":[{"count":13,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/174\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":215,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/174\/revisions\/215"}],"up":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/pages\/74"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/rypublik.de\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=174"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}